內蒙古儀誠科學(xué)實(shí)驗室設備有限公司.png)
脈沖場(chǎng)凝膠電泳
當雙鏈DNA分子超過(guò)一定的大小以后，DNA雙螺旋的半徑超過(guò)了凝膠的孔徑，在瓊脂糖中的電泳速度會(huì )達到極限，此時(shí)凝膠不能按照分子大小來(lái)篩分DNA,脈沖場(chǎng)電泳就解決了這一難題
脈沖電泳是在兩個(gè)不同方向的電場(chǎng)，周期性交替進(jìn)行的，DNA分子在交替變換方向的電場(chǎng)中作出反應所需的時(shí)間顯著(zhù)地依賴(lài)于分子大小，DNA 越大，這種構象改變需要的時(shí)間越長(cháng)，重新定向的時(shí)間也越長(cháng)，于是在每個(gè)脈沖時(shí)間內可用于新方向泳動(dòng)的時(shí)間越少，因而在凝膠中移動(dòng)越慢。脈沖場(chǎng)凝膠電泳可以用來(lái)分離大小從10kb到10Mb的DNA分子
脈沖場(chǎng)凝膠電泳
1 儀器： WD-2101A脈沖電泳系統
2 配套試劑：脈沖電泳專(zhuān)用瓊脂糖(SeaKem Gold Agarose)、TBE
3 染料：GelRed等
在凝膠電泳中，溫度越高，DNA移動(dòng)的速度越快，但是條帶的清晰度和分辨率會(huì )明顯下降。溫度過(guò)高會(huì )導致DNA帶變形或解鏈，一般設置電泳溫度為14℃
常用緩沖液是0.5×TBE
H9812，2.2s-63.8s，19h
脈沖場(chǎng)電泳常見(jiàn)問(wèn)題及解決辦法
1）凝膠在緩沖液中漂浮–蠕動(dòng)泵的速度太快或太慢， 調到合適的速度
2）緩沖液不流動(dòng)或流速慢–檢查冷卻泵：當冷卻泵制 冷時(shí)，如果蠕動(dòng)泵沒(méi)有開(kāi)，會(huì )造成管道內結冰，導 致管道堵塞
3）電泳條帶扭曲–流速太低，導致制冷不充分，或不 均一、緩沖液的體積不能太小
4）條帶變粗–減少上樣量
5）條帶拖尾或模糊–電場(chǎng)轉換時(shí)間不合適，優(yōu)化轉換 電場(chǎng)轉換時(shí)間、上樣量太高，調整樣品濃度
6）大片段DNA不能有效分離–將低電壓、延長(cháng)電場(chǎng)轉換 時(shí)間
7）條帶彎曲–緩沖液緩沖能力下降，更換緩沖液、上 樣時(shí)樣品塊被擠碎、泵速度太慢
聚丙烯酰胺凝膠電泳
聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺（簡(jiǎn)稱(chēng)Acr）和交聯(lián)劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺（簡(jiǎn)稱(chēng)Bis）在引發(fā)劑（eg.APS）和加速劑（eg.TEMED）的作用下聚合并聯(lián)成三維網(wǎng)狀結構的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱(chēng)為聚丙烯酰胺凝膠電泳（簡(jiǎn)稱(chēng)PAGE）。
聚丙烯酰胺凝膠有下列優(yōu)點(diǎn)：
1 在一定濃度時(shí)，凝膠透明，有彈性，機械性能好。
2 化學(xué)性能穩定，與被分離物不發(fā)生化學(xué)反應。
3 對pH和溫度變化較穩定。
4 幾乎無(wú)電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣 品分離重復性好。
5 樣品不易擴散，且用量少。
6 凝膠孔徑可通過(guò)選擇單體及交聯(lián)劑的濃度調節。
7 分辨率高，尤其在不連續凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和 電荷效應為一體，因而較醋酸 纖維薄膜電泳、瓊脂糖電 泳等有更高的分辨率。
聚丙烯酰胺凝膠聚合
聚合原理
1.聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺（Acr）和甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑作用下合成的。 催化系統常用有兩種： 過(guò)硫酸氨—TEMED化學(xué)催化聚合系統 此系統中，四甲基乙二胺（TEMED）稱(chēng)為加速劑，它能以自由基的形式存在。微量的TEMED的加入，可使過(guò)硫酸氨（APS，引發(fā)劑）形成自由基。這些自由基的產(chǎn)生可以引發(fā)丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的交聯(lián)反應，形成具有一定孔徑的聚丙烯酰胺凝膠。
2. 核黃素—TEMED光聚合催化系統 此系統中，核黃素經(jīng)紫外線(xiàn)光解形成無(wú)色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引發(fā)聚合反應。TEMED的存在，可以加速聚合，本催化系統主要用用于大孔濃縮膠的配置。
凝膠孔徑的可調性及性質(zhì)
1）聚丙烯酰胺凝膠的孔徑的大小是由單體和雙體在凝膠中的總濃度（T），以及雙體占總濃度的百分含量（C）即交聯(lián)度決定的。通常凝膠的篩孔、透明度和彈性是隨著(zhù)凝膠濃度的增加而降低的，而機械強度卻隨著(zhù)凝膠濃度的增加而增加
2）凝膠濃度與孔徑的關(guān)系： T與C不僅與凝膠的機械性能有關(guān)，還與凝膠的孔徑關(guān) 系極為密切。一般講，T濃度大，孔徑小，移動(dòng)顆粒 穿過(guò)網(wǎng)孔阻力大。此外，孔徑還同Acr與Bis的比例有 關(guān)，Bis占Acr總濃度5%時(shí)，孔徑最小。
3）凝膠濃度與被分離物相對分子量質(zhì)的關(guān)系：由于凝膠濃度不同，平均孔徑不同，能通過(guò)可移動(dòng)顆粒的相對分子質(zhì)量也不同。在操作時(shí)，可根據被分離物相對分子質(zhì)量大小選擇所需凝膠的濃度范圍。也可先選用7.5%凝膠(標準膠)，因為生物體內大多數蛋白質(zhì)在此范圍內電泳均可取得較滿(mǎn)意的結果。如分析未知樣品時(shí)也可用4%-10%的梯度膠測試，根據分離情況選擇適宜的濃度以取得理想的分離效果。
