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基于泊松分布將核酸樣本分散到大量微孔或者液滴中（如圖1），相較于qPCR而言，dPCR無(wú)需標準曲線(xiàn)（如圖2），抑制成分被有效稀釋?zhuān)ㄈ鐖D3），讀取結果方式具備更精確結果的潛力。盡管有諸多優(yōu)勢，我們仍需重視dPCR的操作過(guò)程、試劑耗材穩定性及硬件性能帶來(lái)的影響；同時(shí)需針對性的完善實(shí)驗細節，從而盡可能減少引入的偏差，獲得高靈敏度、高穩定性的實(shí)驗結果。
圖1.dPCR實(shí)驗原理圖例
（來(lái)源：羅氏診斷整理）
圖2.無(wú)需依靠通過(guò)標準品繪制的標準曲線(xiàn)
（來(lái)源：羅氏診斷整理）
圖3.將樣本分散到微孔后可以降低體系抑制成分的抑制效果
（來(lái)源：羅氏診斷整理）
完整的數字PCR操作流程：
a.取樣過(guò)程：
絕大多數生物學(xué)實(shí)驗在取樣過(guò)程中會(huì )引入取樣偏差，因此在此操作過(guò)程中應盡量保持取得樣本的操作一致，并且在不提高抑制物濃度的條件下，應盡量增大取樣體積，選取低吸附樣本管的耗材。
針對樣本本身，如果是全基因組核酸進(jìn)行數字PCR研究則需要進(jìn)行片段化處理。細菌，病毒等樣本通常需要結合多重靶標檢測，實(shí)驗設計時(shí)需分析靶點(diǎn)序列在基因組上的物理距離，并針對性的設計靶點(diǎn)引物或酶切干預來(lái)減少后續結果中出現的多靶標連鎖問(wèn)題。
b.體系配置：
此步驟主要涉及移液偏差。dPCR儀器移液步驟越多，誤差越大，因此在此操作過(guò)程中盡可能減少移液次數，同時(shí)選擇校準過(guò)的最接近量程的移液器結合合適的低吸附槍頭（如圖4）。
移液操作通常為反向移液，對于低濃度樣本盡可能增加重復以防止低分子隨機性因素導致結果不穩定，高濃度探針引物稀釋后移液可以減少批間誤差。以手動(dòng)單道移液器為例（如圖5），同樣是移取20 μl液體，選擇量程是20 μl的移液器時(shí)精度≤±0.8%，換算成體積為±0.16μl；而選擇量程是200μ的移液器時(shí)精度為≤±6%，體積偏差在±1.2μl 。
圖4.dPCR加樣時(shí)吸頭角度
（來(lái)源：羅氏診斷整理）
圖5.針對不同量程移液器移液過(guò)程的誤差數據
（來(lái)源：羅氏診斷整理）
c.分散過(guò)程：
有效反應單元數量是影響結果準確性和精確性的重要因素（如圖6）。以泊松分布為基礎來(lái)測算核酸濃度，需要在精度和動(dòng)態(tài)范圍之間取得平衡。相同反應單元下，精度要求越高，動(dòng)態(tài)范圍越小，精度要求越小，動(dòng)態(tài)范圍越大，因此提高有效反應單元數量，可同時(shí)提高精度和動(dòng)態(tài)范圍。
圖6.20k,28k,100k微孔數目下，芯片孔越多，計算核酸濃度的準確性越高
（來(lái)源：羅氏診斷整理）
在反應單元一致的前提下，樣本體積越大，越有利于低拷貝基因的檢測。
分散過(guò)程中的誤差分析：統計學(xué)樣本濃度均值λ，即平均一個(gè)分區單元包含λ個(gè)拷貝不一定剛好是真實(shí)模板濃度，需要結合置信區間和置信水平表示,數字PCR中置信水平通常是95%，而針對置信區間科研和商業(yè)化公司有多種計算方式。
???絕對定量誤差分析，見(jiàn)圖例CI區間（如圖7）。
圖7.dPCR絕對定量結果CI統計區間
（來(lái)源：羅氏診斷整理）
???CNV誤差分析更為復雜，需要目標基因和內參基因濃度比ratio值及相應的聯(lián)合置信區間進(jìn)行表示，見(jiàn)圖例CI區間（如圖8）。
圖8.dPCRCNV結果CI統計區間
（來(lái)源：羅氏診斷整理）
d.信號采集：
信號采集過(guò)程中熒光粉塵、交叉污染，都會(huì )影響正常陰陽(yáng)單元的判定，可通過(guò)在超凈臺操作有效降低前者的影響。后者往往對反應單元的信噪比和單元間隔絕性有比較高的要求（如圖9），原理上微滴法很難控制微滴間干擾和液滴融合等問(wèn)題，相較而言以芯片為反應單元的數字PCR設備可以通過(guò)提高微孔工藝進(jìn)而解決此類(lèi)問(wèn)題。
圖9.孔之間應有較大間隔，可以避開(kāi)孔之間的交叉干擾，獲取更好的信噪比
（來(lái)源：羅氏診斷整理）
1D,2D結果中閾值的判讀也是影響最終結果的重要因素。由于試劑耗材組分、非特異性擴增、探針引物二聚體等現象，導致背景噪音更為明顯，導致陰陽(yáng)性孔間閾值難以劃分（如圖10）。優(yōu)化探針引物序列和配比、摸索合適的退火溫度、配合低背景芯片耗材（如圖11），同時(shí)結合硬件，比如結合使用高分辨率的光學(xué)檢測系統、高性能的PCR溫控系統可以有效提高信噪比，使閾值能夠準確劃分。
圖10.1D圖陰性（藍色）與陽(yáng)性（紅色）信號應考察聚集度、信噪比、有無(wú)Rain等指標
（來(lái)源：羅氏診斷整理）
圖11.芯片標準化的六邊形微腔
（來(lái)源：羅氏診斷整理）
以上就是數字PCR實(shí)驗流程常見(jiàn)的幾類(lèi)問(wèn)題和參考性的解決方案。我們在實(shí)驗中面對小分子樣本的隨機性，雖然無(wú)法超越不確定性極限達到確定，但通過(guò)細節把控和數據優(yōu)化，使我們可以通過(guò)高效的方案進(jìn)行實(shí)驗。
*MC-CN-02168 有效期至2025年5月16日
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