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轉自：羅氏診斷生命科學(xué)微信公眾號
什么是dPCR系統的死體積？
預反應體積與反應體積之差稱(chēng)為死體積（dead volume）【1】，其中預反應體積是指分區之前準備的初始體積，包括master mix、引物、探針以及待檢測樣本；反應體積是指被檢測到的分區總體積n×Vp，n為分區總數，Vp為分區體積。
死體積一般是在分區過(guò)程中產(chǎn)生，如制備過(guò)程移液步驟過(guò)多、復雜管路設計、分區過(guò)程的擠壓設計、分區后的穩定性等，有一些儀器的檢測過(guò)程也會(huì )降低樣品的利用率。
任何生物分析都存在二次抽樣誤差，只有部分樣品被分析而不是全部，導致重復檢測之間的統計差異。例如血液樣本處理量可以達到幾毫升，而dPCR檢測體系一般只有幾十微升。二次抽樣是一個(gè)不可避免的誤差來(lái)源，尤其是在樣品中目標分子很少的情況下。由二次抽樣引起的檢測誤差可以由以下公式（1）進(jìn)行計算【2】，其中m是二次取樣中目標分子的數量，對于95%的置信度，Zc應為1.96。
（1）
死體積的存在導致dPCR運行過(guò)程中對樣品進(jìn)行再次抽樣，其引起檢測結果的影響可參考二次抽樣誤差計算。A. Lievens等人也模擬了不同樣品利用率和各種λ值的情況下再次抽樣對結果誤差的影響【3】。
圖1 樣本利用率與檢測誤差率的關(guān)系
圖片來(lái)源：羅氏診斷整理
圖1縱坐標表示誤差超過(guò)25%的結果比例，橫坐標表示用于分析的樣本比例，圖1的A中：藍色表示目的基因λ=0.003，紅色表示目的基因λ=0.015，黃色表示目的基因λ=0.03；圖1的B中：藍色為目的基因λ=0.001，紅色為目的基因λ=0.005，黃色為目的基因λ=0.01。結果表明絕對誤差超過(guò)25%的結果比例與樣品利用率成負相關(guān)，既死體積越大，出現誤差偏高的機率越大。
從一個(gè)簡(jiǎn)單的例子可以進(jìn)一步解釋死體積對dPCR檢測結果，尤其是低拷貝模板的檢出率的影響。
如圖2【4】所示：在不存在死體積的情況下，樣本拷貝數為15，分區數量為15。如死體積率為5%，有效分區數約為14~15，樣品檢出率在12~15拷貝之間；如死體積率為25%，有效分區在11~12，樣品檢出率在4-15拷貝；死體積率為50%，則有效分區數為7~8，樣品檢出率為2~13拷貝。死體積率越高，檢測結果的穩定性越低，檢出限（LOD）也隨之降低，這一效應在低拷貝樣品中尤其明顯。
圖2 dPCR分區
圖片來(lái)源：Journal of Food Protection, Vol. 74, No. 9, 2011, Pages 1404–1412.
與qPCR相比，dPCR檢測過(guò)程需要經(jīng)過(guò)分區這個(gè)過(guò)程，死體積率的出現不可避免，但死體積率與檢測結果的穩定性和檢出限成負相關(guān)，尤其是在檢測低拷貝樣品時(shí)需要重點(diǎn)關(guān)注dPCR系統的死體積率，盡可能選擇死體積率低的系統，以保證結果的準確性。
參考文獻：
【1】Clinical Chemistry, Volume 66, Issue 8, August 2020, Pages 1012–1029 ；
【2】SLAS Technology, Volume 22, Issue 4, August 2017, Pages 369-386 ;
【3】PLoS One, Volume 11, Issue 5, May 2016 ;
【4】Journal of Food Protection, Vol. 74, No. 9, 2011, Pages 1404–1412.
* MC-CN-02328 有效期至2025年8月5日
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