內蒙古儀誠科學(xué)實(shí)驗室設備有限公司.png)
PCR:即聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction)，利用DNA 在體外95°C時(shí)解旋(變
性)，55°C時(shí)引物與單鏈按堿基互補配對的原則結合(退火)，再調溫度至72°C左右, DNA
聚合酶沿著(zhù)磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈(延伸)
PCR儀實(shí)際就是一個(gè)溫控設備，能在95'C, 55°C, 72°C之間很好地進(jìn)行溫度控制。根
據DNA擴增的目的和檢測的標準可以將PCR儀分為:普通PCR儀，梯度PCR儀，原位PCR
儀，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀等幾類(lèi)。
普通PCR儀:
-般把一次PCR擴增只能運行一個(gè)特定退火溫度的PCR儀，稱(chēng)之為普通PCR儀，也就是傳統的PCR儀。如果要用它做不同的退火溫度則需要多次運行。
普通PCR儀主要應用于科研、教學(xué)、臨床醫學(xué)、檢驗、檢疫等。
梯度PCR儀:
PCR反應能否成功，退火溫度是關(guān)鍵，梯度PCR儀每個(gè)孔的溫度可以在指定范圍內按照梯度設置，根據結果，-步就可以摸索出最適反應條件。-次性PCR擴增可以設置-系列不同的退火溫度條件(通常12種溫度梯度)的稱(chēng)之為梯度PCR儀。
不同的DNA片段其最適合的退火溫度不同，通過(guò)設置-系列的梯度退火溫度進(jìn)行擴增，從而一次性PCR擴增就可以篩選出表達量高的最適合退火溫度進(jìn)行有效的擴增。
梯度PCR儀主要用于研究未知DNA退火溫度的擴增，這樣既節約時(shí)間，也節約成本。在不設置梯度的情況下亦可當做普通的PCR用。
梯度PCR儀多應用于分子生物學(xué)、醫學(xué)、食品工業(yè)、司法科學(xué)、生物技術(shù)、環(huán)境科學(xué)、微生物學(xué)、臨床診斷、流行病學(xué)、遺傳學(xué)、基因芯片、基因檢測、基因克隆、基因表達等領(lǐng)域以聚合酶鏈式反應( Picymerase Chain Reaction，PCR為特征的、以檢測DNA/RNA為目的的各種病原體檢測及基因分析。
原位PCR儀
PCR是提取細胞或組織中的DNA進(jìn)行基因擴增反應，而原位PCR是保持細胞或組織的完整性，使PCR反應體系滲透到組織和細胞中，在細胞的靶DNA所在的位置上進(jìn)行基因擴增。
不但可以檢測到靶DNA，而且還可以了解靶DNA存在于何種細胞中，更有利于探討靶DNA與細胞之間的關(guān)系。
原位PCR儀主要應用于：（1）檢測外源性基因片段，提高檢出率，集中在病毒感染的檢查上，如HIV、HPV、HBV、CMV等；（2）觀(guān)察病原體在體內分布規律；（3）內源性基因片段，如人體的單基因病、重組基因、易位的染色體、Ig的mRNA片段、癌基因片段等；（4）檢測導入基因；（5）遺傳病基因檢測如β－地中海貧血。 
實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀:
在普通PCR儀設計基礎.上增加熒光信號采集系統和計算機分析處理系統，形成了具有熒光定量功能的PCR儀器。其PCR擴增原理和普通PCR擴增原理相同，在PCR擴增時(shí)加入的引物是利用同位素、熒光素等進(jìn)行標記，使用引物和熒光探針同時(shí)與模板特異性結合擴增。擴增的結果通過(guò)熒光信號采集系統實(shí)時(shí)采集信號連接輸送到計算機分析處理系統，得出量化的實(shí)時(shí)結果輸出。
熒光定量PCR儀有單通道，雙通道和多通道之分。當只用-種熒光探針標記的時(shí)候，選用單通道;有多種熒光標記的時(shí)候使用多通道。單通道也可以檢測多熒光的標記和目的基因表達產(chǎn)物，因為一次只能檢測一種目的基因的擴增量,需多次擴增才能檢測完不同的目的基因片段的量。多通道利于做多重PCR,實(shí)現一次檢測多種目的基因的功能。
熒光定量PCR儀主要應用于臨床醫學(xué)檢測、生物醫藥研發(fā)、食品行業(yè)、科研院校等。熒光定量檢測技術(shù)在臨床診斷方面很多，主要集中在各種病原體引起疾病的臨床診斷，如肝炎類(lèi)疾病、性病、與優(yōu)生優(yōu)育相關(guān)的疾病以及肺結核等等。
通道: channel指的是針對每一種熒光的檢測器，比如你在-一個(gè)管中做多個(gè)顏色，針對多個(gè)靶基因。每個(gè)顏色需要-個(gè)檢測器來(lái)檢測熒光信號的強弱，每一個(gè)針對不同顏色的檢測器，就是一個(gè)通道。在使用有些廠(chǎng)家5通道的熒光定量?jì)x時(shí)，為了確保實(shí)驗結果的精確性和準確性都要在實(shí)驗中使用ROX(一種熒光染料，ROX是作為內參的，即參照和校正實(shí)驗結果。在ABI的機器里顯示為紅色的水平線(xiàn)。如果你的擴增線(xiàn)在剛開(kāi)始的時(shí)候就高于ROX證明有基因組DNA污染。)或專(zhuān)用的Referencedye，這些熒光染料都必須單獨使用-個(gè)檢測通道。這樣以來(lái)，真正能檢測多重PCR熒光信號的有效通道只有4個(gè)，而且使用校正染料可能會(huì )增加后期的使用成本。有的熒光定量PCR的檢測通道是只為自己廠(chǎng)家的專(zhuān)用的熒光染料或試劑開(kāi)放的，有效檢測通道也絕非像宣傳資料中宣稱(chēng)的那么多。
選擇單通道實(shí)驗還是多通道實(shí)驗？
這是要根據實(shí)驗需要來(lái)選擇的，如果有一個(gè)、兩個(gè)或是三個(gè)基因要進(jìn)行比較,并用看家基因進(jìn)行對照，可以考慮選擇多通道實(shí)驗。多通道實(shí)驗的好處是可以消除樣本加樣的誤差。但要克服的困難也比較多，一是條件的優(yōu)化比較麻煩， 即多種PCR反應以及探針要在同一個(gè)反應條件下進(jìn)行，并且效率都要比較，高，另一個(gè)困難是要求相互之間沒(méi)有干擾，因為干擾會(huì )影響到實(shí)驗結果。還有一一個(gè)困難是當一個(gè)基因的模板數顯著(zhù)大于其他基因時(shí)，因為共用核音酸等資源的原因，會(huì )讓模板數少的基因的定量值變小或變?yōu)榱?。因此一般兩通道的?shí)驗比較多些，即一個(gè)基因進(jìn)行多樣本比較，用看家基因進(jìn)行對照。
硬件設計:傳統的96孔板的熒光定量PCR可以容納的樣本量大，而且無(wú)需特殊的耗材。有些傳統的96孔板的儀器采用鹵鎢燈激發(fā)、CCD檢測，這些光學(xué)結構在96孔板的頂部，每個(gè)樣品孔距光源和檢測器的光程各不相同一-邊緣效應，對結果產(chǎn)生影響。為了保證精確、準確的實(shí)驗結果，這類(lèi)儀器在實(shí)驗過(guò)程中通常會(huì )使用ROX (-種熒光染料)或專(zhuān)用的Reference dye作為參照校正實(shí)驗結果。鹵鎢燈的使用壽命短、更換成本較高已經(jīng)成為很多用戶(hù)頭痛的問(wèn)題。在實(shí)驗過(guò)程中鹵鎢燈作為一種熱光源，產(chǎn)生較多熱能對實(shí)驗結果有一定的影響。CCD最大的優(yōu)點(diǎn)就是可以同時(shí)掃描所有樣品中的熒光信號，但是靈敏度較低，而且同時(shí)檢測樣品間的熒光信號存在干擾。像ABI、Bio-rad 公司生產(chǎn)的熒光定量PCR就屬于這一種。
創(chuàng )新的離心式的儀器通常選用LED激發(fā)、PMT檢測，離心式的設計上避免了邊緣效應。LED光源是冷光源對實(shí)驗沒(méi)有影響，因此無(wú)需采用其他熒光染料校正儀器，而且使用壽命長(cháng)無(wú)需經(jīng)常更換。PMT每次只能收集.單個(gè)熒光信號，但是檢測靈敏度高。但這類(lèi)儀器運行速度非?？?，但也存在樣本量小、耗材昂貴、沒(méi)有梯度功能、存在時(shí)間積分等缺點(diǎn)。Corbett 的Rotor-gene系列和Roche的Lightcycler 系列均為這一.類(lèi)儀器。
在熒光定量PCR儀的眾多技術(shù)參數中，升降溫速度也是廠(chǎng)家喜歡大力宣傳的指標。更快的升降溫，可以縮短反應進(jìn)行的時(shí)間，而且縮短了可能的非特異性結合、反應的時(shí)間，提高PCR的特異性。
